Hipotiroidisme kongenital masih merupakan masalah kesehatan di Indonesia dengan prevalensi sebesar 0,33%. Penegakan diagnosis pada balita yang selama ini dikenal sebagai gold standard dilakukan melalui penentuan TSH serum. Sedangkan penapisan pada bayi baru lahir dilakukan dengan penentuan TSH bloodspot. Penentuan TSH bloodspot ini memiliki kelebihan yaitu: lebih mudah, nyaman dan murah. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode bloodspot untuk diagnosis hipotiroidisme pada balita di Indonesia. Penelitian ini dilaksanakan di klinik BP2GAKI Magelang dan lima puskesmas di Kabupaten Magelang selama 6 bulan. Jenis penelitian non intervensi, desain penelitian potong lintang. Subjek penelitian anak balita usia 2-5 tahun dengan terduga hipotiroidisme. Subjek penelitian diperiksa kadar TSH serum dan bloodspot darah kapiler. Kemudian dilakukan uji validitas dengan crosstab terhadap penentuan TSH bloodspot dibandingkan dengan TSH serum sebagai gold standard. Dari uji statistik penentuan TSH bloodspot dibanding serum diperoleh data: Sensitivitas=25%; Spesiftas=100%; Nilai Duga Positif=100%; Nilai Duga Negatif=93%; Rasio Kemungkinan Positif= ~; Rasio Kemungkinan Negatif= 0.75. Disarankan untuk menggunakan TSH serum dalam pemeriksaan fungsi tiroid balita. Penentuan TSH serum tidak dapat digantikan oleh penentuan bloodspot untuk diagnosis hipotiroidisme pada balita. Kata kunci: TSH bloodspot, TSH serum, hipotiroidisme, balita